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本试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中传染性胸膜肺炎放线杆菌DNA，用于传染性胸膜肺炎放线杆菌的的定性检测，其检测结果仅供辅助参考，不可用于临床诊断。

• 本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。
  
• 不要使用过期组分或者不同批次组分混合使用。
  
• 使用时尽量避免反复冻融，冻融应不超过5次，否则建议分装后使用。
  
• 样本采集和处理过程应遵循生物安全管理要求。
  
• 荧光PCR实验严格分区操作，各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循单方向工作原则，各工作区相对隔离。
  
• 测试样本时，应做好生物安全防护。
  
• 试验完毕后，使用过的试剂盒、样本和试剂应进行无害化处理。

• 样本采集
  
  • 拭子样本：采集口鼻拭子样本。在装有拭子的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30sec。尽量吸出液体移到离心管中6000rpm离心20sec，取上清备用
    
  • 体液样本：取气管分泌物、唾液、鼻涕置于灭菌的收集管中。
    
  • 组织样本：取肺脏，支气管，扁桃体每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。
• DNA提取
  可采用PCR试剂盒配备的核酸提取液，按以下说明进行核酸快速提取。
  对上述固体样本取黄豆粒大小加入50μL核酸提取液；液体样本取50μL加入50μL核酸提取液；100℃恒温处理5min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL离心管，-20℃保存。
  
  • 阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样本制备区域加入阳性对照。
• 试剂准备
  
  • 从试剂盒中取出猪传染性胸膜肺炎放线杆菌反应液，完全复融并振荡混匀后，瞬时离心。
    
  • 设所需的PCR反应管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，配制加样见下表，瞬时离心后尽快扩增检测。
    

    成分	用量
    猪传染性胸膜肺炎放线杆菌反应液	15μL×N
    样本核酸/阳性对照/阴性对照	5μL×N
    总体积	20μL×N

• PCR反应程序
  

  反应过程	循环数	反应参数
  产物消化	1	50℃ 2min
  预变性	1	95℃ 3min
  PCR扩增	40	95℃ 15sec
  		60℃ 30sec

  • 在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。
    
  • 使用ABI品牌仪器时，需将淬灭基团改为NONE，请勿选择ROX参比荧光。
• 试验成立判定：
  
  • 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线；
    
  • 阳性对照(APP-PTC)：均产生扩增曲线；
    
  • 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
• 结果判定：
  

  	Ct值≤35	无Ct值	35≤Ct值≤40且有明显扩增曲线
  FAM	阳性+	阴性-	可疑样本

  对于可疑样本，重新提取核酸，再次进行对应的PCR检测。如果重复结果Ct值≤40且出现对数扩增曲线判为样本阳性；否则判为样本阴性。